KIMIA BAHAN ALAM

Isolasi dan Indentifikasi senyawa terpenoid

1.      Ekstraksi
Ekstraksi senyawa terpenoid dilakukan dengan dua cara yaitu :
 a.   Sokletasi
    Seberat 1000 g serbuk kering herba meniran disokletasi dengan 5 L pelarut n –heksana. Ekstrak n-heksana dipekatkan lalu disabunkan dalam 50 mL KOH 10%. Ekstrak n-heksana dikentalkan lalu diuji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri
            b. Maserasi
    Seberat 1000 g serbuk kering herba meniran dimaserasi menggunakan pelarut metanol. Ekstrak metanol  dipekatkan lalu dihidrolisis dalam 100 mL HCl 4 M. Hasil hidrolisis diekstraksi dengan 5 x 50 mL n–heksana. Ekstrak n-heksana dipekatkan lalu disabunkan dalam 10 mL KOH 10%. Ekstrak n-heksana dikentalkan lalu diuji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri.

   2.   Uji aktivitas antibakteri
Ekstrak n-heksanaa diuji aktivitasnya terhadap bakteri Eschericia coli danStaphyloccocus aureus dengan tahap – tahap sebagai berikut :
 Diambil sebanyak satu koloni biakan bakteri Eschericia coli dengan menggunkan jarum ose yang dilakukan secara aseptis.
 Dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 2 mL Mueller-Hinton broth kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35ºC .
 Suspensi bakteri homogen yang telah diinkubasi siap dioleskan pada permukaan media Mueller-Hinton agar, secara merata dengan menggunakan lidi kapas yang steril.
Kemudian ditempelkan disk yang berisi sampel, standar tetrasiklin serta pelarutnya (n-heksana) yang digunakan sebagai kontrol.
   Lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35ºC .
Dilakukan pengukuran daya hambat zat terhadap bakteri.
Untuk biakan bakteri Staphyloccocus aureus dilakukan dengan cara yang sama seperti biakan bakteri Eschericia coli, namun suhunya berbeda yaitu pada suhu 37ºC

Ekstrak yang positif terpenoid dan paling aktif antibakteri dipisahkan mengunakan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel 60 dan fase gerak kloroform : metanol (3 : 7). Fraksi-fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom diuji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri. Fraksi yang positif terpenoid dan paling aktif antibakteri dilanjutkan ke tahap pemurnian menggunakan kromatografi lapis tipis. Isolat yang relatif murni selanjutnya diidentifikasi menggunakan kromatogafi gas – spektroskopi massa.
Hasil ekstraksi dengan cara sokletasi dan maserasi menunjukkan bahwa ekstrakn-heksana pada kedua cara tersebut positif mengandung senyawa terpenoid. Hal ini dibuktikan dengan terbentuknya warna ungu setelah ekstrak nheksana direaksikan dengan Pereaksi Lieberman Burchard. Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap ekstrak n-heksana hasil sokletasi memberikan daya hambat yang lebih besar dibandingkan ekstrakn-heksana hasil maserasi. Terhadap ekstrak n-heksana hasil sokletasi dipisahkan mengunakan kromatografi kolom menghasilkan tiga buah fraksi yang dipaparkan pada Tabel 1.

Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa fraksi A dan fraksi C positif terpenoid yaitu memberikan warna merah muda (positif diterpenoid) pada fraksi A dan warna ungu muda (positif triterpenoid) pada fraksi C setelah direaksikan dengan pereksi Lieberman-Burchard.
Fraksi yang positif terpenoid selanjutnya dilakukan uji aktivitas antibakteri. Dari hasil uji aktivitas antibakteri fraksi A memberikan daya hambat yang lebih baik sehingga fraksi A dilanjutkan ke tahap pemurnian. Hasil pemurnian menunjukkan noda tunggal. Hal ini dapat dikatakan fraksi A relative murni secara KLT. Isolat yang relatif murni diidentifikasi menggunakan kromatografi gas – spektroskopi massa. Kromatogram gas fraksi n-heksana positif terpenoid dan aktif antibakteri yang menunjukkan terdapatnya dua buah puncak dengan waktu retensi berturut-turut : 25,74 dan 21,93 menit. Berdasarkan data di atas senyawa tersebut mengandung dua buah senyawa.
Setelah difragmentasi, struktur phytadiene mengikuti pola fragmentasi senyawa pada puncak I, dengan demikian senyawa pada puncak I diduga sebagai senyawaphytadiene berdasarkan data Spektroskopi Massa, pola fragmentasi dan hubungan antara senyawa puncak I dengan phytol, phytadiene dan dodekane.
Berdasarkan data hasil penelusuran internet, terdapat struktur senyawa yang memiliki berat molekul m/z 336 dengan gugus dan pola fragmentasi yang memenuhi gugus dan pola fragmentasi senyawa pada puncak II, senyawa tersebut adalah 1,2-seco-cladiellan. Berdasarkan data di atas ditarik suatu kesimpulan yaitu senyawa puncak II diduga sebagai senyawa 1,2–seco–cladiellan, karena struktur senyawa ini memenuhi pola fragmentasi senyawa puncak II.
PERMASALAHAN :
Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa fraksi A dan fraksi C positif terpenoid yaitu memberikan warna merah muda (positif diterpenoid) pada fraksi A dan warna ungu muda (positif triterpenoid) pada fraksi C setelah direaksikan dengan pereksi Lieberman-Burchard.Dari hasil uji aktivitas antibakteri fraksi A memberikan daya hambat yang lebih baik sehingga fraksi A dilanjutkan ke tahap pemurnian. Hasil pemurnian menunjukkan noda tunggal. Hal ini dapat dikatakan fraksi A relative murni secara KLT. Isolat yang relatif murni diidentifikasi menggunakan kromatografi gas – spektroskopi massa.

 mengapa fraksi A memberikan daya hambat yang lebih baik sehingga fraksi A dilanjutkan ke tahap pemurnian ?? Apakah warna atau noda tunggal yang dihasilkan mempengaruhi proses pemurnian secara KLT.??