Penentuan Struktur Senyawa Terpenoid

PENENTUAN STRUKTUR SENYAWA TERPENOID DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA AKTIF ANTIMAKAN DARI DAUN TENGGULUN (Protium javanicum Burm. F.)

TERHADAP LARVA Epilachna sparsa L

Protium merupakan genus terbesar dari keluarga Burseraceae yang secara tradisional telah dimanfaatkan sebagai obat, kosmetik, dan insektisida. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi golongan senyawa aktif antimakan dari daun Protium Javanicum Burm F, yang di Bali dikenal dengan nama tenggulun. Larva Epilachna sparsa (E.sparsa) digunakan sebagai bioindikator untuk uji aktivitas antimakan yang dilakukan baik terhadap crude ekstrak, fraksi maupun isolat. Serbuk kering daun tenggulun (1000 g) diekstraksi dengan metanol sehingga diperoleh ekstrak kental berwarna hijau kehitaman (20,89 g). Ekstrak ini menunjukkan aktivitas antimakan 71,61% pada konsentrasi 0,1% b/v, maka selanjutnya dipisahkan dengan cara difraksionasi sehingga diperoleh fraksi n-heksana, kloroform, dan air. Fraksi kloroform menunjukkan aktivitas antimakan paling tinggi yaitu 89,52%, sedangkan fraksi n-heksana 36,83%, dan air 1,96% pada konsentrasi 0,1% (b/v). Pemurnian fraksi aktif kloroform dilakukan dengan kromatografi kolom silika gel menggunakan campuran pelarut n-heksana : kloroform (3:4) sebagai fase gerak menghasilkan tiga kelompok fraksi (isolat). Isolat yang menunjukkan aktivitas antimakan relatif paling tinggi yaitu 70,53% dan murni diidentifikasi dengan uji fitokimia dan spektroskopi inframerah serta ultraviolet-visibel. Hasil identifikasi menunjukkan isolat aktif antimakan merupakan senyawa golongan triterpenoid dengan gugus fungsi OH; CH3; CH2; C=O, dan C=C serta menyerap sinar UV-Vis pada λmax 245 dan 416 nm.

Tenggulun (Protium javanicum Burm. F.) yang merupakan salah satu spesies dari genus protium, secara kemotaksonomi juga diduga mempunyai aktivitas insektisida sebagai penolak serangga sehingga secara tidak langsung tumbuhan akan terlindungi dari serangga hama karena nafsu makan hama sudah dihambat. Uji pendahuluan kandungan kimia daun tenggulun dilaporkan mengandung senyawa dari golongan flavonoid, sterol, terpenoid, kuinon dan tanin (Eniek, 1997).

Hasil uji pendahuluan yang dilakukan pada eksrak metanol menunjukkan daun tenggulun (Protium javanicum Burm. F.) bersifat antimakan dengan persentase aktivitas antimakan 71,61% pada konsentrasi 0,1% (b/v). Untuk itu, dalam penelitian ini akan dilakukan identifikasi golongan senyawa aktif antimakan dari daun tenggulun (Protium javanicum Burm. F.) terhadap larva Epilachna sparsa.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi

Hasil maserasi terhadap 1000 g serbuk kering daun tenggulun (Protium javanicum Burm. F.) dengan metanol diperoleh ekstrak kental metanol (crude ekstrak) berwarna hijau kehitaman seberat 20,89 g. Ekstrak kental metanol ini kemudian diuji aktivitas antimakan terhadap E. sparsa dan hasilnya disajikan pada Tabel 1.

Ekstrak metanol menunjukkan aktivitas antimakan yang cukup besar yaitu sebesar 71,61% terhadap larva E. Sparsa pada konsentrasi larutan uji 0,1%, sehingga berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut sebagaipestisida nabati. Suatu bahan dikatakan bersifat aktif antimakan apabila memiliki persentase antimakan lebih besar atau sama dengan 25%. Untuk pemisahan dan pemurnian senyawa aktif antimakan diawali dengan partisi untuk mengelompokkan senyawa yang terkandung berdasarkan kepolarannya (Fessenden dan Fessenden, 1995).

Partisi

Partisi terhadap 20,89g crude ekstrak metanol menghasilkan fraksi n-heksana (3,68 g), fraksi kloroform (2,55 g), dan fraksi air (9,10 g). Ketiga fraksi diuji aktivitas antimakannya terhadap larva E. sparsa. Hasil uji aktivitas antimakan masing-masing fraksi hasil partisi yaitu fraksi kloroform (K), n-heksana (H), dan air (A) dipaparkan pada Tabel 2.

Fraksi kloroform paling aktif terhadap larva E.sparsa, karena pada konsentrasi 0,1% (b/v) menunjukkan aktivitas antimakan tertinggi yaitu 89,62% di bandingkan dengan fraksi n-heksana 36,83%, dan fraksi air yang hanya 1, 96%. Oleh sebab itu, fraksi kloroform dilanjutkan pada proses pemisahan dan pemurnian menggunakan kromatografi kolom (Anom, 1999).

Kromatografi Kolom

Pemisahan komponen-komponen pada fraksi aktif kloroform dilakukan dengan kromatografi kolom. dengan silika gel 60 sebagai fase diam, dan fase gerak yang digunakan adalah campuran eluen terbaik yang diperoleh dari analisis KLT yaitu kloroform : n-heksana (3:4). Hasil pemisahan terhadap 1 g fraksi aktif kloroform menghasilkan 123 botol eluat. Eluat-eluat yang diperoleh kemudian danalisis dengan KLT dan eluat-eluat yang mempunyai pola pemisahan yang sama yaitu jumlah noda dan harga Rf yang sama digabungkan sehingga diperoleh tiga kelompok fraksi gabungan yaitu fraksi A, B, dan C seperti tertera pada Tabel 3. Fraksi A masih terdiri dari empat noda yang berarti ada 4 komponen, sedangkan fraksi B dan C terdiri dari satu noda.

Identifikasi

Identifikasi isolat aktif antimakan (fraksi B diawali dengan uji fitokimia untuk memperoleh informasi mengenai golongan senyawa kimianya sebagai kerangka dasar dari struktur senyawa dalam elusidasi struktur. Hasil uji fitokimia disajikan pada Tabel 5.

Tabel 5.			Hasil uji fitokimia terhadap isolat antimakan Fb
No	Uji Fitokimia	Pereaksi		Perubahan warna	Kesimpulan
1	Flavonoid	NaOH 10% HCl - Mg H2SO4		Hijau-hijau muda Hijau-hijau muda Hijau-hijau	Negatif Negatif Negatif
2	Triterpenoid	Libermann – Burchard		Hijau-keunguan	Positif
3	Steroid	Libermann – Burchard		Hijau-keunguan	Negatif
4	Kuinon	KOH 10% dalam metanol Borntrager		Hijau-hijau	Negatif
5	Tanin	Gelatin		Hijau-hijau	Negatif

Gambar 1.

Spektrum Inframerah dari isolat Fb.

Dari hasil uji fitokimia seperti dapat dilihat pada Tabel 5, isolat aktif antimakan merupakan senyawa golongan triterpenoid karena menunjukkan reaksi positif dengan pereaksi triterpenoid, Libermann-Burchard. Beberapa senyawa aktif antimakan yang diisolasi dari Melia azacadarach (mindi), Azadirachta indica (mimba) (Maria, C, 2003), merupakan senyawa golongan triterpenoid. Senyawa aktif antimakan seperti azadirachtin yang diisolasi dari Melia azacadarach (mindi) merupakan senyawa golongan terpenoid yang diduga beraksi pada otot usus serangga sehingga otot usus menjadi tegang dan menurunkan motilitasnya akibatnya nafsu makan serangga akan menurun (Segatri Putra, 1989).

Isolat aktif antimakan ini selanjutnya dianalisis sifat fisikokimianya dengan spektrofotometer inframerah dan Ultraviolet-visible. Spektrum inframerah isolat aktif antimakan ditunjukkan pada Gambar 1, sedangkan data bilangan gelombang, bentuk pita, intensitas, dan penempatan gugus terkait dipaparkan pada Tabel 6.

Hasil analisis spektra inframerah menunjukkan adanya serapan melebar pada daerah bilangan gelombang 3433,29 cm-1 yang merupakan serapan dari gugus OH terikat, dugaan ini diperkuat dengan munculnya serapan pada daerah bilangan gelombang 1226,73 cm-1 yang merupakan serapan dari C-O alkohol. Munculnya pita serapan pada daerah bilangan gelombang 2924,09 cm-1 dan 2854,65 cm-1 diduga adalah serapan dari gugus CH3 dan CH2 yang didukung dengan munculnya serapan pada daerah bending yaitu pada bilangan gelombang 1365,60 cm-1 dan 1465,90 cm-1. Serapan tajam pada daerah bilangan gelombang 1743,65 cm-1 diduga adalah serapan dari gugus karbonil gugus C=O. Pita serapan pada daerah bilangan gelombang 1612,49 cm-1 diduga serapan dari C=C alifatik (Silverstain et al., 1991; Sastrohamidjojo, 1991). Hasil interpretasi dari spektrum inframerah maka isolat diduga mempunyai gugus fungsi –OH, -CH alifatik C=O, dan C=C alifatik. Sedangkan hasil analisis spektrum UV-Vis dari isolat dapat dilihat pada Gambar 2 dan data untuk panjang gelombang, absorbansinya dan jenis transisi dapat dilihat pada Tabel 7.

Identifikasi dengan UV-Vis memberikan informasi adanya kromofor maupun auksokarom dalam isolat. Jenis kromofor atau auksokrom dapat diketahui dari energi transisi elektron. Energi transisi elektronik digambarkan dari nilai absorbansi isolat karena absorbansi menggambarkan perbedaan energi elektron dalam keadaan dasar dengan energi elektron tereksitasi (Creswell et al., 1982).

Identifikasi dengan UV-Vis memberikan informasi adanya kromofor maupun auksokarom dalam isolat. Jenis kromofor atau auksokrom dapat diketahui dari energi transisi elektron. Energi transisi elektronik digambarkan dari nilai absorbansi isolat karena absorbansi menggambarkan perbedaan energi elektron dalam keadaan dasar dengan energi elektron tereksitasi (Creswell et al., 1982).

Tabel

Bilangan gelombang (cm-1)		Bentuk Pita			Intensitas	Kemungkinan Gugus Fungsi
Spektra					Pustaka
3433,29	3450-3200		Lebar	Sedang			-OH terikat (stretching)
2924,09	2960-2870		Tajam	Sedang			-CH alifatik (-CH3 stretching)
2854,65	2960-2870		Tajam	Sedang			-CH alifatik (-CH2 stretching)
1743,65	1820-1600		Tajam	Kuat			-C=O karbonil
1612,49	1650-1500		Tajam	Lemah			-C=C alifatik (stretching)
1465,90	1500-1400		Tajam	Kuat			-CH alifatik (-CH2 bending)
1365,60	1500-1400		Tajam	Sedang			-CH alifatik (-CH3 bending)
1226,73	1300-1000		Tajam	Sangat lemah			-C-O alkohol (bending) -C-C (bending)
802,39	880-758		Tajam	Kuat			=CH siklik (bending)
594,08	675-400		Tajam	Sangat lemah			-CH keluar bidang (bending)

Hasil analisis isolat dengan spektrofotometri UV-Vis menghasilkan tiga serapan utama yang muncul pada panjang gelombang 245; 416 dan 663 nm. Serapan yang terjadi pada panjang gelombang 245 nm dengan absorbansi terbesar kemungkinan disebabkan oleh terjadinya transisi elektronik π → π* yaitu transisi elektron dari gugus taks jenuh seperti kromofor C = C. Dugaan ini diperkuat dari data spektrum inframerah dengan munculnya serapan dari C = C alifatik pada daerah bilangangelombang 1612,49 cm-1. Serapan pada panjang gelombang 416 nm kemungkinan disebabkan terjadinya transisi elektronik n → σ* yaitu transisi elektron dari gugus jenuh O-H yang mempunyai elektron non bonding seperti pada auksokrom. Dugaan ini diperkuat dari data spektrum inframerah dengan munculnya serapan dari gugus O=H pada daerah bilangan gelombang 3433,29 cm-1 (Silverstain et al., 1991; Sastrohamidjojo, 1991). Serapan pada panjang gelombang 663 kemungkinan terjadinya transisi elektronik n → π* yaitu transisi elektron dari suatu gugus tak jenuh yang mempunyai elektron non bonding sperti pada kromofor C = O.

Dari hasil identifikasi, maka dapat disimpulkan isolat aktif antimakan yang diisolasi dari daun tenggulun merupakan senyawa golongan triterpenoid dengan gugus fungsi O-H, C-H alifatik, C=O dan C=C alifatik dan memberikan serapan maksimum pada λmax. 245 dan 416 nm.

Simpulan

Isolat dari daun tenggulun (Protium javanicum Burm. F.) menunjukkan aktivitas antimakan terhadap larva E. sparsa sebesar 70,53%, pada konsentrasi 10 ppm. Identifikasi isolat aktif antimakan menunjukkan isolat adalah senyawa dari golongan triterpenoid yang mempunyai gugus fungsi OH, CH3, CH2, C=O, dan C=C serta memberikan serapan karakteristik UV-Vis pada panjang gelombang, λmax 245 dan 416 nm.

pertanyaan :
1. Suatu bahan dikatakan bersifat aktif antimakan apabila memiliki persentase antimakan lebih besar atau sama dengan 25%. Apakah apabila ada senyawa terpenoid lain yang bukan anggota triterpenoid yang mengikuti kriteria yang disebutkan sebagai antimakan bisa diidentifikasi menjadi senyawa antimakan walaupun strukturnya berbeda ???
2.Isolat yang menunjukkan aktivitas antimakan relatif paling tinggi yaitu 70,53% dan murni diidentifikasi dengan uji fitokimia dan spektroskopi inframerah serta ultraviolet-visibel. Hasil identifikasi menunjukkan isolat aktif antimakan merupakan senyawa golongan triterpenoid dengan gugus fungsi OH; CH3; CH2; C=O, dan C=C serta menyerap sinar UV-Vis pada λmax 245 dan 416 nm.
Apakah selain ultraviolet - visibel ada yang bisa digunakan untuk menguji struktur triterpenoid tersebut ??? dan apabila sinar yang diserap  melebihi atau kurang dari  rentang yang ditentukan , apakah senyawa antimakan tersebut akan tetap didapatkan ???