PENENTUAN STRUKTUR ALKALOID

  Penentuan Struktur Alkaloid Pada  FRAKSI ETIL ASETAT DAUN KESUM
(Polygonum minus Huds)

  
Struktur Alkaloid  Berdasarkan kedudukan atom N :
N 1’ atau punya gugus amin primer misalnya meskaline
N 2’ atau amin sekunder misal koniin
N 3’ atau amin tersier misal atropine
N 4’ atau amin kuarterner misal tubocurarine
Alkaloid Amida (netral)
Alkaloid fenolik

Uji Kemurnian
 Uji kemurnian terhadap isolat dilakukan dengan kromatografi lapis tipis menggunakan beberapa macam eluen, yaitu n-heksana : etil asetat (8:2), n-heksana : aseton (7:3). Kemudian menggunakan KLT dua dimensi dengan eluen n-heksana : etil asetat (8:2). Jika kromatogram menunjukkan satu pola noda, maka dapat dikatakan isolat tersebut relatif murni. Titik leleh isolat ditentukan menggunakan alat pengukur titik leleh (melting point apparatus).

Karakterisasi Senyawa
Isolat relatif murni yang diperoleh kemudian dianalisis dengan instrumen spektrofotometer UV-Vis, IM dan spektrometer RMI-1H dan RMI-13C. Data yang diperoleh diinterpretasi untuk mengkarakterisasi dan menentukan struktur senyawa yang terkandung di dalam daun kesum (Polygonum minus Huds)

Berdasarkan uji alkaloid terhadap fraksi metanol, n-heksana dan etil asetat diketahui bahwa fraksi metanol dan etil asetat menunjuk- kan hasil positif mengandung senyawa alkaloid. Sementara fraksi n-heksana memberi hasil negatif, hal ini dikarenakan senyawa alkaloid terdistribusi pada pelarut yang bersifat polar. Pada penelitian ini, fraksi yang dipilih untuk diteruskan tidak hanya berdasarkan hasil uji alkaloid saja. Faktor pertimbangan lainnya adalah berat fraksi. Hal ini disebabkan banyaknya tahapan pemisahan dan pemurnian yang harus dilakukan. Jika jumlah fraksi terlalu sedikit dikhawatirkan akan habis sebelum diperoleh isolat yang relatif murni. Berdasarkan pertimbangan tersebut, dipilih fraksi etil asetat yang diteruskan untuk dilakukan pemurnian dan pemisahan. Pemisahan dan pemurnian dilakukan dengan cara kromatografi vakum cair dan Kromatografi Kolom Tekan (KKT).
 Hasil akhir KKT didapat 7 fraksi gabungan (B1-B7) kemudian diuji alkaloidnya. Berdasarkan hasil KLT dan uji alkaloid didapatkan fraksi B5 yang mengandung senyawa alkaloid dan memperlihatkan pola noda tunggal. Fraksi B5 sebanyak 19 mg berbentuk amorf berwarna hijau tua. Fraksi B5 yang dipilih untuk dianalisis, terlebih dahulu dilakukan uji kemurnian yang meliputi analisis KLT satu dan dua dimensi serta uji titik leleh. Analisis KLT satu dimensi dilakukan dengan menggunakan beberapa eluen, yaitu : n-heksana : etil asetat (8:2), n-heksana : aseton (7:3) dan kloroform 100%. Kromatogram KLT satu dimensi fraksi B5 ditunjukan pada Gambar 1.
 
     A                   B                 C
Gambar 1. Profil kromatogram satu dimensi
fraksi B5 dengan menggunakan eluen (a) nheksana
: etil asetat (8:2), (b) n-heksana :
aseton (7:3) dan (c) kloroform 100%

Uji kemurnian dari fraksi B5 selanjutnyadilakukan dengan KLT dua dimensi menggunakan  eluen n-heksana : etil asetat (8:2). Profil kromatogram fraksi B5 secara KLT dua dimensi ditunjukkan pada Gambar 2.

Gambar 2. Profil kromatogram dua dimensi fraksi B5. Bagian yang dilingkar merupakan penampakan noda tunggal fraksi B5.

Berdasarkan Gambar 1 dan 2 dapat diketahui bahwa isolat dari fraksi B5 menampakkan noda  berbentuk tunggal pada kromatogram. Bentuk noda tunggal tersebut menunjukan bahwa isolat B5 hasil isolasi relatif murni. Isolat B5 yang diperoleh berupa padatan amorf berwarna hijau tua dan mempunyai titikleleh 85-87  (tidak terkoreksi). Isolat B5 relatif murni yang didapat kemudian diteruskan ke tahap identifikasi. Isolat dianalisis dengan instrumen spektrofotometer UV-Vis, IM dan spektrometer RMI-1H dan RMI-13C. Spektrum UV isolat B5 memberikan serapan pada panjang gelombang 210, 220, 250, 270 dan 285 nm.
Spektrum IM isolat B5 memperlihatkan adanya serapan pada daerah bilangan gelombang 3483 cm-1 (N-H), 3311 cm-1 (O-H), 2925 cm-1 (C-H), 1735 cm-1 (C=O), 1458 cm-1 (C=C), 1379 cm-1 (C-N), 1168 cm-1 (C–O) (Hart dkk., 2003). Spektrum IM isolat B5 dapat dilihat pada Gambar 4.
   
             Gambar 4. Spektrum Inframerah isolat B5.
Data spektrum IM isolat B5 menunjukan bahwa terdapat gugus fungsi utama yaitu gugus amida (-CO-NR2) dan gugus metil (C-H). berdasarkan analisis spektrum IM maka dapat  diasumsikan bahwa isolat B5 merupakan senyawa alkaloid, karena senyawa ini memiliki gugus fungsi NH pada strukturnya. Spektrum (RMI-1H) Isolat B5 menunjuk- an adanya sinyal triplet pada δH 0,89 (J= 3 Hz), sinyal multiplet pada δH 1,35 (J= 13 Hz), sinyal singlet pada δH 3,60 (J= 0,25 Hz), sinyal kuartet pada δH 3,98 (J= 1 Hz) dan sinyal singlet pada δH 8,14 (J= 0,1 Hz). Spektrum (RMI-1H) Isolat B5 dapat dilihat pada gambar 5.

                   Gambar 5. Spektrum (RMI-1H) isolat B5
Spektrum (RMI-13C) menunjukkan bahwa terdapat 14 sinyal karbon yang terdiri dari sinyal-sinyal untuk sebuah karbon kwarterner (C), tujuh buah karbon metin (CH), dua buah karbon metilen (CH2), dua buah karbon metil (CH3). Kemudian terdapat pula sinyal untuk CH-OH dan sebuah sinyal untuk C=O. Spektrum (RMI-13C) Isolat B5 dapat dilihat pada gambar 6
    \
                            Gambar 6. Spektrum (RMI-13C) Isolat B5 Berdasarkan data spektrum UV dan IM dapat diperoleh asumsi awal bahwa isolat B5 merupakan senyawa alkaloid indol yang tersubstitusi pada cincin pirol. Keberadaan alkaloid pada isolat B5 juga diperkuat dengan adanya gugus amida yang memberikan serapan kuat pada bilangan gelombang 3483-3610 cm-1 untuk vibrasi ulur (N-H) (Hart dkk., 2003).
Puncak serapan pada λmaks 285 nm menunjukkan isolat B5 mengandung kromofor benzena. Posisi substitusi pada suatu cincin benzena dapat dilihat dari spektrum inframerahnya. Cincin-cincin benzena yang tersubstitusi mempunyai karakteristik absorpsi pada 680-900 cm-1 (Fessenden & Fessenden, 1986). Spektrum IM isolat B5 tidak menampakan adanya serapan pada rentang tersebut, sehingga dapat diduga bahwa senyawa alkaloid pada isolat B5 memiliki cincin benzen yang tidak tersubstitusi. Berdasarkan analisis tersebut maka diprediksi struktur dari isolat B5 adalah senyawa alkaloid Indol dengan struktur terlihat pada Gambar 7.
 
Gambar 7. Prediksi Struktur alkaloid indol yang tersubstitusi pada cincin pirol.

PERTANYAAN :
Senyawa isolat B5 yang diperoleh sebanyak 19 mg berupa padatan amorf berwarna hijau tua dan mempunyai titik leleh sebesar 86-87oC. maka diprediksi bahwa isolat B5 adalah senyawa alkaloid golongan indol . Bagaimana caranya menetapkan bahwa fraksi B5 mengandung alkaloid indol dibanding fraksi lainnya (ada B1-B7) dilihat dari spektrum RMI , UV dan INFRAMERAH nya ???